식품약품안전청고시 제2007-10호

식품등 중 기준규격미설정 물질의 시험방법 제정

2007. 2. 27

식품의약품안전청

식품의약품안전청고시 제2007-10호

식품등 중 기준 및 규격이 설정되지 아니한 물질(“기준규격미설정 물질”)의 시험방법을 다음과 같이 제정 고시합니다.

2007년 2월 27일

식품의약품안전청장

식품등 중 기준규격미설정 물질의 시험방법 제정

1. 제정이유

식품위생법 제7조 및 제9조의 기준 및 규격이 설정되지 아니한 물질(“기준규격미설정 물질“)에 대한 시험방법을 제정하여 식품안전관리 사전조사 및 모니터링 등에 활용하고자 함.

2. 주요내용

가. 제1조(목적), 제2조(정의), 제3조(적용범위)

나. 제4조(시험방법)

○ 식품 중 트랜스지방

○ 식품 중 아크릴아마이드

○ 주류 중 에틸카바메이트

○ 굴 중 노로바이러스

○ 장출혈성 대장균

○ 식품 중 다이옥신류

식품등 중 기준규격미설정 물질의 시험방법

제1조(목적) 이 고시는 「식품위생법」제7조 및 제9조의 기준 및 규격이 설정되지 아니한 물질에 대한 시험방법을 정함으로써 식품안전관리 사전조사 및 모니터링 등에 활용하는 것을 목적으로 한다.

제2조(정의) 이 고시의 “기준규격미설정 물질”은 식품위생법 제7조 및 제9조에 따라 식품공전에 기준 및 규격이 고시되어 있지 아니한 물질을 말한다.

제3조(적용범위) 식품등 중 기준규격미설정 물질에 대한 시험방법은 이 고시를 따른다.

제4조(시험방법)

1. 식품 중 트랜스지방

가. 정의

“트랜스지방”은 트랜스 구조를 1개 이상 가지고 있는 모든 불포화지방을 말한다. 여기서 “불포화지방”은 이중결합이 있는 지방을 말하며, 이중결합이 2개 이상일 때에는 메틸렌기에 의해 분리되거나 또는 비공액형의 이중결합을 가지고 있는 지방으로 한정한다.

나. 분석법의 적용 범위

여기에서 제시하는 트랜스지방 분석법은 정제된 식물성 유지나 경화, 혹은 부분경화 시킨 식물성 유지 및 비 반추동물에서 기인하는 유지를 대상으로 한다. 유제품이나 반추동물에서 기인하는 유지, 어유, 장쇄 다중불포화지방산을 다량 함유하는 유지 및 공액이중리놀레산 제품의 트랜스지방 분석에는 부적절하다.

다. 조지방 추출

조지방 추출은 시료에 따라 식품공전상의 방법에 따라 시행한다.

라. 측정기기

가스크로마토그래피/불꽃이온화검출기

마. 시약 및 시액

1) 14% 트리플루오로보란메탄올

2) 메탄올성 수산화나트륨용액(0.5N) : 수산화나트륨 2g을 메탄올 100㎖에 녹인다. 장시간 방치하는 경우 흰 침전(Na2CO3)이 생길 수 있으나 이는 무시하여도 된다.

3) 이소옥탄: 가스크로마토그래피용

4) 지방산 표준물질

- 지방산메틸에스터(37종) 혼합 표준물(Supelco, 미국)

- 18:2, 18:3의 시스, 트랜스 이성체 표준물질(Sigma, 미국)

5) 표준용액 : 지방산 혼합 표준물 약 0.1g을 이소옥탄에 녹여 100㎎/㎖가 되도록 제조한다.

바. 시험용액의 조제

1) 지방의 가수분해

에테르 등의 용매를 이용하여 식품에서 추출한 유지는 에스터 결합하고 있는 형태이므로 가수분해하는 과정이 우선 필요하다. 지방의 가수분해는 다음과 같이 행한다.

① 지방 및 유지 검체 약 25㎎를 유리 튜브에 취한다.

② 0.5N 메탄올성 수산화나트륨용액 1.5㎖를 가하고 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮고 혼합한다.

③ 100℃ heating block에서 약 5분간 가온한다.

④ 30～40℃로 냉각한다.

2) 지방산 유도체화

지방산을 메틸에스터로 유도체화시키는 방법으로 1)의 방법으로 가수분해 시킨 후 혹은 산분해법으로 추출한 시료의 경우 적용한다.

① 14% 트리플루오르보란 메탄올용액 2㎖를 가하고 다시 질소를 불어 넣은 후 즉시 뚜껑을 덮고 혼합한다.

② 100℃에서 2분간 가온한다.

③ 30∼40℃ 로 냉각하여 이소옥탄용액 1㎖를 가하여 질소를 불어넣은 후 뚜껑을 덮고 이 온도에서 30초간 격렬히 교반한다.

④ 포화 염화나트륨용액 5㎖를 가하고 질소를 불어넣은 다음     뚜껑을 덮고 격렬히 교반한다.

⑤ 상이 분리되도록 상온에서 방치한다.

⑥ 상층인 이소옥탄층을 무수황산나트륨이 있는 새 유리 튜브에 넣고 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮고 수분을 제거한다.

⑦ 수분을 제거한 메틸에스터용액을 GC에 주입하여 기기분석을 시행한다.

※ 식품공전 제7. 일반시험법, 1.일반성분시험법, 4)지질,(4)지방산 <제1법> 사용 가능.

사. 시험조작

1) 기기 조건

지방산 분석시 기기 조건은 다음과 같다. C18:1과 C18:2, C18:3의 시스, 트랜스지방의 이성체의 분리는 180℃의 등온조건에서 진행하며, 이후에는 승온조건을 사용할 수 있다.  만일 20:1과 ccc-18:3가 제대로 분리되지 않으면 칼럼온도를 다시 조정 할 수 있다.

① 가스크로마토그래피 조건

- 칼럼 : SP-2560 (100m x 0.25mm x 0.2㎛) 혹은 이와 동등한 것

- 주입부온도 : 250℃

- 칼럼온도 : 180℃에서 40분간 유지한 후 3℃/min의 비율로 230℃까지 온도를 상승시키고 이후 10분이상 유지한다.

- 검출기온도 : 280℃

- 유량 : 헬륨 혹은 수소 1.0㎖/min

- split ratio : 50 : 1

② 지방산 표준물질의 크로마토그램

37종의 지방산 표준물질 및 18:2와 18:3의 시스, 트랜스 이성체의 표준물질의 크로마토그램은 그림 1-1, 1-2와 같다. 통상적으로 트랜스형의 이성체는 시스형보다 먼저 분리된다. ccc 18:3과 20:1의 피크 순서는 칼럼의 종류 및 분석온도에 따라 상이하며 트랜스지방산의 분리조건을 최적화 시키는 데에는 20:1의 피크가 ccc 18:3 바로 앞에 나오는 것이 좋다(SP-2560의 경우, 그림 1-3).

일부 18:3의 트랜스형의 이성체는 γ-linoleic acid의 피크와 겹치므로 먼저 지방산을 분석하여 이를 우선 확인하거나 GC-mass나 기타 방법을 이용하여 피크를 재확인하는 것이 필요하다.

그림 1-1. 지방산 표준물질의 크로마토그램

그림 1-2. 18:2 및 18:3 트랜스, 시스 이성체 표준물질 및 CLA의 크로마토그램

그림 1-3. 시스형 및 트랜스형 지방산의 판별

③ FID conversion factor

지방산 함량 계산에 필요한 FID 전환계수(FID conversion factor, Ri)는 표준물질의 피크면적 및 함량을 이용하여 다음과 같이 계산한다. 18:1, 18:2, 18:3 지방산의 트랜스 이성체들은 각각 올레인산, 리놀레산, 리놀렌산의 FID 전환계수를 사용한다.

Ri =	Psi	×	WC11:0
	PC11:0		Wsi

Ri : 각 지방산별 검출기 상대반응계수

Psi : 각 지방산 표준물의 피크면적

PC11:0 : C11:0의 면적

WC11:0 : C11:0의 함량

Wsi : 각 지방산 표준물질의 함량

i : 지방산의 종류

④ 지방산 전환계수

GC-FID상에서의 분석은 각 지방산의 메틸에스테르이므로 해당 지방산으로 전환해야 한다. 각 지방산 별 전환계수는 표 1-1에 제시되어 있다. 트랜스형의 지방산인 경우 시스형의 경우와 동일한 전환계수를 사용한다.

표 1-1. 메틸에스테르에서 해당 지방산으로의 전환계수

지방산 명	fi
4:0	0.8431
6:0	0.8923
8:0	0.9114
10:0	0.9247
11:0	0.9300
12:0	0.9346
13:0	0.9386
14:0	0.9421
14:1	0.9417
15:0	0.9453
15:1	0.9449
16:0	0.9481
16:1	0.9477
17:0	0.9507
17:1	0.9503
18:0	0.9530
18:1	0.9527
18:2	0.9524
20:0	0.9570
18:3 n-6	0.9520
18:3 n-3	0.9520
21:0	0.9588
20:1 n-9	0.9568
20:2	0.9565
20:3, n-6	0.9562
20:3 n-3	0.9562
20:4 n-6	0.9560
20:5 n-3	0.9560
22:0	0.9604
22:1 n-9	0.9602
22:2	0.9600
22:6 n-3	0.9591
23:0	0.9620
24:0	0.9630
24:1	0.9632

⑤ 시료의 크로마토그램

부분 경화유의 크로마토그램은 그림 1-4에 제시되어 있다.

그림 1-4. 부분 경화유의 크로마토그램

⑥ 계산법

시료의 구성 지방산 별로 지방산 100g 당 g 함량을 계산한다. 이 분석법은 식물성 정제유지 또는 가공유지의 트랜스 지방산을 측정하는 방법으로 트랜스 지방산의 함량은 (t 18:1)과 [(tt+ct+tc) 18:2], [(ttt+ttc+tct+ctt+cct+ctc+tcc)18:3]의 합으로 나타낸다.

FAi (g/100g 지방산)	=	Pi × fi	×	100
		Ri		∑ (Pj × fj / Rj )

Pi, Pj : 지방산 피크면적

Ri, Rj : 각 지방산 표준물질에서 구한 FID 전환계수

fi, fj : 각 지방산 메틸에스테르로부터 지방산으로의 전환계수(표 1-1)

아. 트랜스지방 함량 계산

트랜스지방 함량은 조지방 함량에 구성 지방산 중 트랜스지방산 총량을 곱한 것을 트랜스지방 함량으로 한다.

트랜스지방 (g/100g 식품)	=	조지방함량(g/100g 식품)×트랜스지방산 함량(g/100g 지방산)
		100

2. 식품 중 아크릴아마이드

검체를 균질화하고 물로 추출한 후 SPE (Solid Phase Extraction) 컬럼을 이용하여 정제한 후 얻어진 시험용액을 액체크로마토그래프/질량분석기에 주입하여 MRM (Multiple reaction monitoring)을 이용하는 분석방법이다.

가. 측정기기

액체크로마토그래프 : 질량분석기 (LC/MS/MS)를 사용한다.

나. 시약 및 기구

1) 메탄올 : HPLC용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : HPLC용 또는 이와 동등한 것

3) 2-프로판올 : HPLC용 또는 이와 동등한 것

4) 정제컬럼

- OASIS HLB (충진제 : C8 200㎎, 용량 : 6㎖) 또는 이와 동등한 것

- Bond Elut-Accucat (충진제 : C8, SAX, SCX 200㎎, 용량 : 3㎖)　또는 이와 동등한 것

5) 표준원액 : 아크릴아마이드 표준품을 정밀히 달아 물에 녹여

1㎎/㎖가 되게 한다.

6) 내부표준원액 : 탄소13 동위원소(13C3)로 치환된 아크릴아마이드가 메탄올에 녹아 있는 용액 (1㎎/㎖)을 사용한다.

7) 표준용액 : 표준원액에 물을 가해 적당한 농도로 희석하여 사용 한다.

8) 내부표준용액 : 내부표준원액에 0.1% 개미산을 가해 200ng/㎖가 되게 한다.

9) 검량곡선표준용액 : 표준용액과 내부표준용액에 물을 가해 내부표준용액의 농도는 20ng/㎖가 되게 하고, 표준용액은 적당한 5개 이상의 농도가 되게 제조한다.

10) 여과튜브 : Maxi-spin filter tube (규격 : 0.45㎛ PVDF) 또는 이와 동등한 것

11) 기타 : 특급

다. 시험용액의 조제

검체는 믹서기를 이용하여 균질화 한 후 1g을 정밀히 취하여 50㎖ 폴리프로필렌 코니컬 튜브에 넣고 내부표준용액 1㎖와 물 9㎖를 가한 후 잘 혼합하여 진탕기에 넣어 180～200rpm으로 20분 동안 추출한 후 원심분리기를 이용하여 9000rpm으로 30분 동안 원심분리한다. 이후 원심분리하여 얻어진 물층 5㎖를 여과튜브에 옮기고 7000rpm으로 10분간 다시 원심분리하여 A액을 얻는다. 메탄올 3.5㎖와 물 3.5㎖로 활성화시킨 OASIS HLB SPE 카트리지에 A액 1.5㎖를 넣어 통과시킨 후 물 0.5㎖를 흘려버리고 물 1.5㎖를 용출시켜 모아 B액을 얻는다. 메탄올 2.5㎖와 물 2.5㎖로 활성화시킨 Bond Elut-Accucat SPE 카트리지에 B액 1.5㎖를 넣은 후 처음 0.5㎖를 흘려버리고 이후 얻어진 1㎖를 액체크로마토그래프의 시험용액으로 한다.

라. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 측정조건

① 칼럼 : C18 (2 x 250 ㎜, 5㎛) 또는 이와 동등한 것

② 이동상 : 0.1% 초산과 0.5% 메탄올을 포함하는 수용액

③ 유속 : 0.2 ㎖/min

④ Post-column makeup flow rate : 50 ㎕/min (1% 초산을 포함하는 2-프로판올)

⑤ 칼럼온도 : 35℃

⑥ 주입량 : 20 ㎕

⑦ 이온화방식 : ESI(positive)

⑧ MRM ions

- 아크릴아마이드(precursor to product) : m/z 72→55

- 탄소13 동위원소(13C3)로 치환된 아크릴아마이드(precursor to product) : m/z 75→58

⑨ Sheath gas : 질소(35 psi)

⑩ Capillary temperature : 340℃

⑪ Auxiliary gas : 질소(15 psi)

⑫ Collision gas : 아르곤

⑬ Collision energy : 11V～13V

※주의 : Collision energy는 기기의 특성에 따라 tuning하여 분석조건을 재설정 할 수 있음.

2) 정성 및 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입하여 아크릴아마이드와 탄소13 동위원소(13C3)로 치환된 아크릴아마이드의 MRM이온의 피크 머무름시간(Retention time)을 확인한다. 이후, 검량곡선표준용액에서 얻어진 표준물질 및 내부표준물질의 피크면적 비[AS/AIS]를 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 피크면적비[ASAM/ASAMIS]를 Y축에 대입하여 아크릴아마이드의 농도를 계산한다 (정량한계 : 10ng/g).

AS : 검량곡선표준용액의 표준물질 피크면적

AIS : 검량곡선표준용액의 내부표준물질 피크면적

ASAM : 시험용액의 아크릴아마이드 피크면적

ASAMIS : 시험용액의 내부표준물질 피크면적

3. 주류 중 에틸카바메이트

검체를 고체상 정제컬럼(충진제 : 규조토)에 흡착시키고 디클로로메탄으로 용출한 후, 농축하여 얻어진 시험용액으로부터 에틸카바메이트의 선택이온(m/z 62, 74, 89)을 질량분석기를 사용하여 정성 및 정량하는 분석방법이다.

가. 측정기기

기체크로마토그래프 : 질량분석기(GC/MS)를 사용한다.

나. 시약 및 시액, 기구

1) 아세톤 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

2) 디클로로메탄 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

3) 물 : 증류수 또는 이와 동등한 것

4) 정제컬럼 : Chem Elut (규격 : 50㎖) 또는 이와 동등한 것

5) 표준원액 : 에틸카바메이트 표준품을 정밀히 달아 아세톤에 녹여 1000㎍/㎖가 되게 한다.

6) 내부표준원액 : 부틸카바메이트 표준품을 정밀히 달아 아세톤에 녹여 1000㎍/㎖가 되게 한다.

7) 표준용액 : 표준원액에 아세톤을 가해 10㎍/㎖가 되게 한다.

8) 내부표준용액 : 내부표준원액에 아세톤을 가해 10㎍/㎖가 되게 한다.

9) 내부표준첨가용액 : 내부표준용액에 물을 가해 400ng/㎖가 되게 한다.

10) 검량곡선표준용액: 표준용액과 내부표준용액에 디클로로메탄을 가해 내부표준물질 농도는 400ng/㎖, 표준물질은 6개 농도(50, 100, 200, 400, 800, 1600ng/㎖)로 되게 제조한다.

※ 주의 : 사용된 용매는 에틸카바메이트의 특정이온 m/z 62, 74 및 89 피크가 없어야 하며 디클로로메탄은 200배 농축하여 확인함.

다. 시험용액의 조제

검체 5g를 비이커에 정밀히 달아 내부표준첨가용액 1㎖을 첨가하고 물을 가해 40g이 되게한 후 정제컬럼에 넣고 물 10㎖로 비이커의 잔류물을 씻어 정제컬럼으로 옮긴다. 이후, 4분간 정치하여 흡착시킨 후 디클로로메탄 80㎖로 2회 용출한다. 용출액을 플라스크에 모아 30℃의 수욕조에서 2～3㎖까지 감압농축 한다. 농축액을 파스테르 피펫을 이용하여 눈금있는 KD 수기로 옮기고 플라스크에 남아있는 농축액을 1㎖ 디클로로메탄으로 2회 되풀이하여 씻어 옮긴 후, 질소 하에서 1㎖로 정확히 농축하여 기체크로마토그래프의 시험용액으로 한다.

라. 시험조작

1) 가스크로마토그래프의 측정조건

① 칼럼 : DB-WAX column(30m×0.25mm ID, 0.25㎛df) 또는 이와 동등한 것

② 주입부 : splitless mode, 180℃

③ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨, 0.9㎖/min.

④ 오븐온도 : 40℃에서 시료를 주입하고 0.75분간 유지하고 10℃/분으로 60℃까지 승온하고 3℃/분으로 150℃까지 승온하여 5분이상 유지한다. (연속분석을 위하여 220℃에서 4.25분이상 유지한다.)

⑤ 이온화방식 : Electron impact

⑥ 이온화에너지: 70eV

⑦ Solvent delay time : 10분

⑧ 선택이온질량(m/z) : 62, 74, 89

2) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 표준용액과 시험용액의 전체 선택이온(m/z 62, 74, 89)의 크로마토그램 상의 표준물질 및 내부표준물질의 피크 머무름시간(Retention time)은 일치하여야 하며, 시험용액의 선택이온 중 m/z 62와 74의 반응세기의 비(Response ratio)는 에틸카바메이트 표준물질의 선택이온 간 반응세기의 비와 비교할 때, 그 상대비가 20% 이내에서 일치하여야 하며 m/z 89 이온은 확인되어야 한다.

3) 정량시험

검량곡선표준용액에서 얻어진 표준물질과 내부표준물질의 m/z 62의 피크에 대한 면적비[AS/AIS]를 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 면적비[ASAM/ASAMIS]를 Y축에 대입하여 에틸카바메이트의 농도를 계산한다(정량한계: 10ng/g).

AS : 검량곡선표준용액의 표준물질 피크면적

AIS : 검량곡선표준용액의 내부표준물질 피크면적

ASAM : 시험용액의 에틸카바메이트 피크면적

ASAMIS : 시험용액의 내부표준물질 피크면적

4. 굴 중 노로바이러스

가. 검체의 채취 및 취급

1) 검체의 채취

① 굴은 채취 전 조직이 손상되지 않았는지 확인하고, 깨끗한 물로 씻어 모래나 진흙이 제거된 상태여야 한다.

② 플라스틱 백 등에 얼음이나 아이스 팩을 넣은 후 검체를 채취하며, 얼음 녹은 물 등이 검체에 오염되지 않도록 별도의 포장을 하여야 한다.

③ 채취 후 냉장상태를 유지하면서 4시간～24시간 이내에 검사기관에 검사의뢰 하여야 한다.

④ 냉동 굴의 채취에는 검체가 녹지 않도록 냉동 상태를 유지하여 운반하여야 한다.

2) 검체의 보관

① 냉장상태로 보관하며, 24시간 내에 실험을 진행한다.

② 냉동 굴은 -15℃ 이하의 온도에서 실험 전까지 보관한다.

3) 검체의 준비

① 냉동상태의 검체는 실온에서 녹여 검체를 준비한다.

② 흐르는 물에 조심스럽게 검체를 헹구어 검체에 남아있는 진흙이나 모래를 제거한다.

③ 칼을 양쪽 껍질 사이로 삽입하여 패각을 개봉한 후 가위를 이용하여 한쪽 면에 남아있는 패각 끈을 제거한다.

④ 패각이 제거된 검체로부터 다음의 시험방법에 의하여 중장선을 분리하여 검체로 사용한다.

※ 검체의 채취장소와 계절에 따라 중장선의 크기나 무게는 차이가 날수 있다.

4) 주의 사항

검체 취급 시 공기에 의한 검체의 교차 오염에 특별히 주의하여야 한다.

나. 시약 및 시액, 기구

1) 0.25M glycine-0.14M NaCl (pH 7.5)

Glycine 18.76g과 NaCl 8.2g을 증류수 800㎖에 녹인 후 pH를 7.5로 맞춘 후 최종 1000㎖이 되도록 증류수를 가하고 121oC에서 15분간 고압증기 멸균하여 사용한다.

2) 0.25M threonine-0.14M NaCl (pH 7.5)

Threonine 29.8g과 NaCl 8.2g을 증류수 800㎖에 녹인 후 pH 7.5로 조정하여 최종 1000㎖이 되도록 하여 121oC에서 15분간 고압증기멸균 후 사용한다.

3) DEPC 처리 증류수

증류수 500㎖에 Diethyl pyrocarbonate (DEPC) 0.5㎖을 가한 후 강하게 흔들어주고 정치하는 것을 여러 차례 반복한 후, 적어도 16시간 이상 방치한 다음 121oC에서 15분간 고압증기멸균 후 사용한다.

4) 40% polyethylene glycol (PEG)

400g의 PEG 6,000에 증류수 900㎖을 가하여 녹인 후 최종 1000㎖이 되도록 하여 멸균된 0.22㎛ 필터로 여과한 후 사용한다.

5) 0.2% Tween 80-50mM Tris-HCl

10% Tween 80 0.2㎖과 1 M Tris-HCl 0.5㎖(pH 7.2)에 증류수를 가하여 최종 10㎖이 되도록 하여 사용한다.

6) RNA 분리용 kit

Magnetic silica bead RNA Extractor를 이용한다. RNA의 분리용 시액의 구성성분은 ① Lysis & binding 용액, ② Washing buffer I 용액, ③Washing buffer II 용액, ④ Elution 용액, ⑤ Magnetic beads로 구성되어있다. MagExtractor Viral RNA Kit (TOYOBO사, cat no. NPK-401, Japan)이나, GM Autoprep Kit (GM사, cat. no. 716297, Korea) 등을 사용하거나 이와 동등 이상의 결과(재현성)를 얻을 수 있는 상업적 kit를 선택하여 사용할 수 있다.

다. 시험방법

1) 바이러스 추출

가위 또는 수술용 칼과 핀셋 등을 사용하여 굴 연체부의 내부에서 중장선(그림 4-1)을 분리한다. 중장선(검은색을 띄고 있어 쉽게 판별 가능함) 주위에 붙어 있는 조직을 가능한 조심스럽게 제거한 후, 중장선만을 약 10g을 모아 멸균된 원심분리용 튜브에 옮긴다. 0.25M Glycine-0.14M NaCl 완충액(pH 7.5) 75㎖를 가하여 스토마커를 이용하여 1차 균질화한 후, Homogenizer를 이용하여 2차적으로 조직을 균질화시킨다. 완전히 균질화된 검체를 원심분리용 튜브에 옮겨 10,000×g로 4oC에서 30분간 원심분리한 후, 1차 상층액을 새로운 원심분리용 튜브에 옮긴 후, 침전물은 0.25M Threonine-0.14M NaCl (pH 7.5) 75㎖을 가하여 실온에서 침전물과 완충액이 완전히 섞일 때까지 진탕한다. 10,000×g로 4oC에서 30분간 원심분리 후 얻어진 2차 상층액과 1차 상층액을 합하여 다음의 바이러스 농축 시험을 실시한다. 양성대조군으로는 중장선 약 10g에 폴리오바이러스(sabin 1 type) 1,000 pfu(plaque forming unit)를 가하고 증류수 50㎖을 첨가한 후 pH를 3.0으로 맞추어 30분간 정치시킨다. 10,000×g로 4oC에서 30분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 상기 검체와 동일한 바이러스 추출 과정을 실시한다.

그림 4-1. 굴의 중장선 위치

2) 바이러스 농축

1)에서 얻어진 상층액 150㎖(1차 상층액 + 2차 상층액)에 40% PEG를 66㎖을 첨가하고, 3M NaCl 24㎖을 가한 후, 4oC에서 3시간이상 방치하여 1차 침전을 실시한다. 10,000×g로 4oC에서 20분간 원심분리한 후, 침전물을 0.2% Tween 80-50 mM Tris-HCl 2㎖과 증류수 8㎖에 녹인 후 chloroform : isoamyl alcohol (24:1) 10 ㎖를 가하여 강하게 혼합한다. 10,000×g로 4oC에서 30분간 원심분리한 후 상층액 약 9㎖을 조심스럽게 취한 후 원심분리용 튜브에 옮긴다. 경계부분에 증류수 10㎖과 chloroform : isoamyl alcohol 10㎖을 가하여 강하게 혼합한 후 10,000×g로 4oC에서 30분간 원심분리 후 상층액 약 9㎖을 조심스럽게 취하여 앞 단계에서 얻어진 상층액과 합한다. 이 용액 약 18㎖에 40% PEG를 10㎖과 3M NaCl 3㎖을 가하여 4oC에서 3시간 방치하여 2차 침전을 실시한다. 16,000×g로 4oC에서 30분간 원심분리한 후, 상층액을 완전히 제거하고 검체의 침전물을 DEPC 처리된 증류수 500㎕에 현탁시킨다.

3) RNA의 분리 (Magnetic silica bead RNA Extractor)

실험에 사용할 RNA 분리용 kit의 적절한 실험법에 준하여 바이러스 RNA를 추출하고, 추출된 RNA액 5㎕를 RT-PCR을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

4) RT-PCR 및 1차 PCR

노로바이러스 유전자형(genotype) 확인을 위하여 primer 조합을 달리하여 동시에 수행한다. PCR 반응조건은 RT(reverse transcription)-PCR과 1차 PCR을 한 시험관에서 동시에 수행하는 one step RT-PCR 방법을 사용한다.

① GI type에 대한 PCR 반응조건은 RT-PCR pre-mix 10㎕, primer 20pmol (GI-F1M, GI-R1M)  2㎕와 추출 RNA 5㎕가 함유되도록 한다.

② GII type에 대한 PCR 반응조건은 RT-PCR pre-mix 10㎕, primer 20pmol (GII-F1M, GII-R1M) 2㎕와 추출 RNA 5㎕가 함유되도록 한다. 45oC에서 30분간 reverse transcription 반응 후 94oC에서 5분간 DNA를 변성시키고, 94oC 30초, 55oC 30초, 72oC 1분 30초를 1회로 하여 35회 반응시킨 후, 72oC에서 7분간 연장 반응시킨다. 상기 반응 종료 후 PCR 생성물에 대하여 다음의 nested PCR을 실시한다.

③ 대조군의 PCR 반응조건은 RT-PCR pre-mix 10㎕, primer 20pmol (UG1-F, UC1-R) 2㎕을 함유하되 양성대조군은 폴리오바이러스(sabin 1 type) 추출 RNA 5㎕, 음성대조군은 멸균증류수 5㎕이 함유되도록 한다. 42oC에서 30분간 reverse transcription 반응 후 94oC에서 5분간 DNA를 변성시키고, 94oC 30초, 52oC 30초, 72 oC 45초를 1회로 하여 35회 반응시킨 후 72oC에서 7분간 연장반응 시킨다. 대조군의 경우는 nested PCR을 실시하지 않는다.

Primers	Sequences(5'→3')	polarity	size(bp)
GI-F1M	CTGCCCGAATTYGTAAATGATGAT	sense	313
GI-F2	ATGATGATGGCGTCTAAGGACGC	sense
GI-R1M	CCAACCCARCCATTRTACATYTG	antisense
GII-F3M	TTGTGAATGAAGATGGCGTCGART	sense	310
GII-F1M	GGGAGGGCGATCGCAATCT	sense
GII-R1M	CCRCCIGCATRICCRTTRTACAT	antisense
UG1-F	TTTGTGTCAGCGTGTAATGA	sense	480
UC1-R	GAATTCCATGTCAAATCTAGA	antisense

5) Nested PCR

① GI-F1M, GI-R1M primer set로 증폭한 PCR산물 2㎕를 주형으로 하여 Nested PCR을 실시한다. 1차 PCR산물 2㎕, 10x buffer 5㎕, dNTP (10 mM) 4㎕, Taq polymerase (5 unit/㎕) 1㎕와 primer 20pmol (GI-F2, GI-R1M)를 각각 2.5㎕씩 첨가하여 nested PCR을 실시한다.

② GII-F1M, GII-R1M primer set로 증폭한 PCR산물 2㎕를 주형으로 하여 Nested PCR을 실시한다. 1차 PCR산물 2㎕, 10x buffer 5㎕, dNTP (10 mM) 4㎕, Taq polymerase (5 unit/㎕) 1㎕와 primer 20pmol (GII-F3M, GII-R1M)를 각각 2.5㎕씩 첨가하여 nested PCR을 실시한다. PCR 조건은 94oC에서 5분간 DNA를 변성시킨 후 94oC 30초, 55oC 30초, 72oC 1분30초를 1회로 하여 25회를 반응시킨 후 72oC에서 7분간 연장 반응시킨다.

6) 전기영동

PCR 반응 종료 후 반응액 5㎕를 1.5% agarose gel 상에서 100V로 전기영동한 후, EtBr(0.5 ㎍/㎖) 염색액에서 30분간 염색 후 증류수에서 10분간 탈색하고 UV 하에서 DNA 밴드를 관찰한다.

7) 결과 확인

전기영동 결과로부터 목적하는 PCR 증폭 산물이 얻어졌는지 확인한 후 다음과 같이 분석결과를 확인한다.

① 우선 반응 대조군 중 음성대조군에서는 DNA 밴드가 검출되지 않음을 확인하고, 양성대조군에서는 480bp의 폴리오바이러스 DNA 산물이 검출된 것을 확인하여, 이 두 결과가 모두 일치할 경우 다음 단계를 실시한다.

② ①에서 대조군의 결과를 모두 확인한 후, Marker DNA와 비교하여 PCR 산물이 313bp이면 GI 형 노로바이러스, 310bp이면 GII 형 노로바이러스 양성밴드가 검출된 것으로 일차적으로 확인하고, 최종 확인을 위하여 agarose gel상에서 양성밴드만을 절취하여 DNA단편을 정제한다.

8) 최종판정

DNA sequencing 수행을 위하여 7)에서 정제된 DNA 1㎕를 주형으로 바이러스 타입 및 진행방향에 따라 GI의 경우 GI-F2/GI-R1M, GII의 경우 GII-F3M/GII-R1M의 primer 조합을 사용하여 수행한다. PCR 반응 조건은 각각의 바이러스 타입에 따른 nested primer (1 pmol)과 dye-terminator를 첨가하여 증류수로 최종 10 ㎕가 되도록 하여 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 후 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다. DNA sequencing 실시 후 http://www.ncbi.nlm.nih.gov  등에 수재된 노로바이러스 유전자 데이터베이스와 비교하여 노로바이러스로 확인되었을 경우 노로바이러스가 검출된 것(양성)으로 최종 판정한다.

5. 장출혈성 대장균

가. 배지

1) TP(Tryptone Phosphate) Broth (OXOID)

Pancreatic digest of casein        20.0g

NaCl                             5.0g

K2HPO4                          2.0g

KH2PO4                          2.0g

TweenTM 80                     15.0ml

위 성분을 증류수 1L에 완전히 녹이고 가열한 후 121℃에서 15분간 고압증기멸균한다.

2) L-EMB(Levine Eosin Methylene Blue) agar (Difco, BBL)

Agar                            15g

Lactose                         10.0g

Peptone                         10.0g

K2HPO4                         2.0g

Eosin Y                         0.4g

Methylene Blue                  0.065mg

위 성분을 증류수 1L에 완전히 녹이고 가열한 후 121℃에서 15분간 고압증기멸균한다.

나. 시험조작

1) 증균과정

① 시료 25g을 무균적으로 취하여 225㎖ BHI(Brain Heart Infusion) broth를 가하고 수 초간 스토마커한 후 가끔 흔들어 주면서 실온에서 10분간 방치 후 10분간 정치하여 고형물이 가라앉도록 한다.

② 상등액을 새로운 스토마커백으로 조심스럽게 넣은 후 35℃에서 3시간 배양한다.

③ 배양액에 225㎖ 2배농도의 TP(Tryptone phosphate) broth 또는 2배농도 EC Medium을 가한 후 44±0.2℃에서 20시간 배양한다.

2) 분리시험

④ 배양액은 L-EMB agar, MacConkey agar 또는 EMB agar에 접종하여 35℃에서 20시간 배양한다.

⑤ 전형적인 집락(L-EMB: 평평하고 중심부가 흑색 집락, 금속광택 유 또는 무, MacConkey agar: Brick red, EMB: 금속광택성 집락)을 취하여 TSI agar에 접종하여 35℃에서 20시간 배양한다.

3) 확인시험

⑥ TSI에서 sucrose 발효, lactose 발효, 가스생성을 나타내는 집락을 취하여 BHI agar 또는 TSA agar에 접종하여 35℃에서 20시간 배양한다.

⑦ 생화학시험을 실시하여 대장균을 확인한다. (생화학시험에는 API 20E 또는 VITEK 등을 이용할 수 있다)

4) 장출혈성대장균 확인시험

⑧ Verotoxin 확인시험 및 O형 혈청형 확인시험을 실시하여 장출혈성대장균을 확인한다.

6. 식품 중 다이옥신류

가. 적용범위

이 방법은 식품 및 가공소금을 검체로 하며 폴리클로리네이티드 디벤조파라다이옥신(PCDDs; polychlorinated dibenzo-p-dioxins)류 및 폴리클로리네이티드 디벤조퓨란(PCDFs; polychlorinated dibenzofurans)류 중 2,3,7,8-유도체 17종(이하 “다이옥신류” 라 한다)의 분석방법에 대하여 규정한다.

나. 측정기기

고분해능 가스크로마토그래프/고분해능 질량분석계 (High Resolution Gas Chromatograph/High Resolution Mass Spectrometer, HRGC/HRMS)를 사용한다.

다. 시약 및 시액, 기구

시약 및 시액은 다이옥신류 분석에 영향을 미치는 방해성분을 함유하지 않아야 한다.

1) 용매: 잔류농약 분석용 또는 이와 동등한 것.

2) 물 : 헥산 세정 증류수 또는 이와 동등한 것.

3) 무수황산나트륨: PCB 시험용 또는 이와 동등한 것.

4) 정량용표준물질: 다이옥신류의 정성 및 정량에 사용하는 정량용 표준물질은 표 6-1과 같이 2,3,7,8-치환이성체와, 13C12체(labeled) 및 37Cl4체(labeled) (또는 이와 동등한 효과를 갖는 것)를 사용한다.

5) 동위원소표준물질: 시료의 추출과정 전에 첨가하는 13C12체로 된 다이옥신류로 표 6-1과 같은 화합물(또는 이와 동등한 효과를 갖는 것)을 사용한다.

6) 실린지 첨가용 내부표준물질: 가스크로마토그래프/질량분석계에 주입하기 전에 첨가하는 실린지첨가용 내부표준물질은 13C12-1,2,3,4-TCDD(또는 이와 동등한 효과를 갖는 것) 및 13C12-1,2,3,7,8,9-HxCDD(또는 이와 동등한 효과를 갖는 것)를 사용한다.

7) 검량선 작성용 표준물질: 정량용 표준물질을 검출한계부분의 저농도의 것과 예상 검출농도보다 높은 고농도의 것을 적어도 하나 이상 포함시켜 5단계 이상의 농도 범위로 조제한 것(또는 이와 동등한 효과를 갖는 것). 단, 검량선 작성용 표준용액들은 HRGC/HRMS의 동적범위(dynamic range)를 만족해야 하며 검량선 작성용 표준용액에는 정량용 표준물질의 13C12체 및 37C12체가 일정농도로 함유되어 있어야 한다.

8) 대용표준물질: 분석공정상의 회수율을 측정하기 위해 적당한 농도의 다이옥신류(또는 이와 동등한 효과를 갖는 것)를 사용한다. (표 6-1).

9) 점검용 표준물질: 검량선 작성용 표준물질 중 중간농도의 표준물질을 선택하여 점검용 표준물질로 한다.

10) 산성실리카겔 : 중성실리카겔 100g당 농황산 44g을 넣어 잘 흔들어 준다.

11) 실리카겔 칼럼: 안지름 11mm, 길이 177mm의 정제용 칼럼(중성실리카겔 1.5g, 염기성실리카겔 2g, 산성실리카겔 4g의 순서로 충전한 것) 또는 이와 동등한 것.

12) 알루미나 칼럼: 안지름 11㎜, 길이 177㎜의 정제용 칼럼(염기성알루미나 12.5g을 충전한 것)또는 이와 동등한 것.

13) 카본 칼럼: 안지름 11㎜, 길이 10㎜의 정제용 칼럼(8% 카본/celite545-AW 0.275g을 충전한 것) 또는 이와 동등한 것.

14) pH 여지: pH 0～14까지 측정할 수 있는 것 또는 이와 동등한 것.

15) 기타: 다이옥신류 분석에 적합한 것

라. 시험용액의 조제

1) 추출

① 식품(농산물, 축산물, 수산물)

검체 약 15～20g을 취하여 막자사발에 넣고 적당량의 무수황산나트륨을 가하여 수분을 제거한 다음 속실렛 원통형 여지로 옮긴다. 공시료 및 시료에는 동위원소 표준물질을 첨가하고 회수율 측정용 시료에는 동위원소 표준물질 및 대용 표준물질을 첨가하여 비등석을 넣은 추출용매(디클로르메탄:헥산 = 3:1) 30㎖를 넣어 18시간 이상 속실렛 추출한다.

② 소금

검체 약 20g을 취하여 500㎖ 분액여두에 넣고 증류수 100㎖로 녹인 다음 묽은 염산을 사용하여 pH를 2로 조정한다. 공시료 및 시료에는 동위원소 표준물질을 첨가하고, 회수율 측정용 시료에는 동위원소 표준물질 및 대용표준물질을 첨가하여 디클로로메탄 (100㎖)를 넣어 진탕기로 5분간 심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 디클로로메탄층을 취한다. 물 층에 각각 디클로로메탄 100㎖ 및 50㎖를 넣어 위와 같이 되풀이하여 디클로로메탄층을 위의 디클로로메탄층에 합친다. 디클로로메탄을 무수황산나트륨으로 탈수한 다음 40℃ 이하의 수욕상에서 감압하여 날려보낸 후 잔사에 헥산 적당량을 가하여 녹인다. 이후 정제과정은 식품의 정제방법과 동일하다.

2) 지방항량 측정

① 식품(농산물, 축산물, 수산물)

속실렛 추출액을 40℃ 이하의 수욕상에서 감압하여 날려보낸 후 질소농축기를 이용하여 1.5psi로 20분간 농축하며 항량이 될 때까지 반복하여 지방항량을 측정한다.

[eqn: 조지방(%) = {항량(g) -(플라스크 + 비등석)(g)} over {시료양(g) }]

3) 지방제거

① 식품(농산물, 축산물, 수산물)

분액여두에 유리솜을 넣고 유리깔때기를 이용하여 무수황산나트륨 20 g을 넣고 지방 1 g 당 산성실리카겔 10 g을 넣어준다. 지방항량이 끝난 시료에 헥산 3 ㎖를 넣고 충분히 용해한 다음 분액여두에 시료가 묻지 않도록 산성실리카겔 표면에 넓게 뿌려서 넣어준다.  이러한 조작을 두 번 더 반복한 다음 20분간 반응시킨다.  헥산 130～150㎖로 용리한 다음 약 3 ㎖가 남도록 40℃ 이하의 수욕상에서 감압하여 날려보낸다.  남은 농축액을 시험관에 모은 후 감압용기를 헥산 3 ㎖씩 2회 반복 용해하여 이전의 시험관에 합쳐서 추출액으로 한다.

4) 정제

실리카겔 칼럼에 위의 추출액을 가하여 헥산으로 용출시키고 그 용출액을 알루미나 칼럼에 가한 후 2% 디클로로메탄 함유 헥산으로 방해물질을 제거한 다음 50% 디클로로메탄 함유 헥산으로 다시 용출시킨다. 이 알루미나칼럼에 용출액을 카본칼럼에 가하고 50% 에칠초산 함유 벤젠 및 헥산의 순으로 방해물질을 정제한 다음 톨루엔으로 역유출하여 농축한다. 농축액에 실린지 첨가용 내부표준물질을 첨가한 후 시험용액으로 한다.

※주의 : 칼럼크로마토그래피에서 사용하는 충진제나 용매의 종  류 및 양은 표준물질 등으로 분획실험을 하여 정한 것  으로 한다.

마. 시험조작

1) 가스크로마토그래피의 측정조건

① 칼럼 : 안지름 0.32㎜, 길이 60m의 규산유리 캐필러리 칼럼관에 가스크로마토그래프용 5%페닐-메칠실리콘(DB-5)을 교차 결합시킨 것 또는 이와 동등한 것으로 분석하고자 하는 전 이성체의 분리가 양호하며 그 분리 효율을 입증할 수 있는 것이어야 한다.

② 오븐온도 : 이성체 각각의 분리가 양호하며, 크로마토그램 상에서 그 용출순서를 판명할 수 있도록 온도조건을 설정한다. 단, 2,3,7,8-TCDD 및 2,3,7,8-TCDF와 가장 근접한 피크의 계곡은 25% 미만이어야 한다.

③ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨을 적절하게 조절한다.

⑥ 주입부 : 270℃ 또는 이성체 각각의 분리가 양호한 온도

⑦ 연결부 : 290℃ 또는 이성체 각각의 검출이 양호한 온도

⑧ 이온원 : 260℃ 또는 이성체 각각의 검출이 양호한 온도

2) 고분해능 질량분석기의 측정조건

① 튜닝 표준물질 : PFTBA 또는 이와 동등한 것

② 분해능 : 10,000 이상 (10% 계곡 기준)

③ 이온화방식 : 전자충격이온화 방식 (EI)

④ 질량설정 : 측정하고자 하는 각 동족체마다 M+, (M+2)+ 및 (M+4)+ 중 2개의 이온을 선택한다.

⑤ 질량 검정 : 가스크로마토그래프/질량분석계는 시료분석조건과 동일한 조건에서 분해능 10,000 이상으로 조절(tuning)한 다음, 4 염화물에서 8 염화물의 선택이온들을 적당한 그룹으로 나누어 튜닝 표준물질에 대한 질량 검정을 하여야 한다.

⑥ 주기적 점검 : 분석을 지속적으로 수행하는 경우 매 12시간 마다 정량용 표준물질 중 중간농도의 표준물질을 선택하여 기기 성능을 점검하여야 하며 회수율은 80%～120%에 있어야 한다.

⑦ 검출한계 : 염화물 각각의 검출한계는 표 6-2에 나타난 값 이하이어야 한다

3) 정성시험

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 하며, 측정한 선택이온 2개의 이온세기 비율은 표 6-3에 나타난 이론값에 대하여 ±15% 이내에 있어야 한다. 단, 모든 신호 대 잡음(S/N)비는 2.5보다 커야 하며, 정량용 13C12 및 37C12의 경우는 10보다 커야 한다.

4) 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 검출된 각각의 다이옥신류에 대해 이에 대응하는 정량용 13C12체 및 37C12체 표준물질로 상대검량선법으로 정량한다. 또한 동위원소 표준물질 37C4체-2,3,7,8-TCDD와 13C12-2,3,7,8 등 15종의 내부표준물질에 대한 농도를 절대검량선법으로 구하여 회수율을 계산하며 회수율은 50% 이상 120%이하이어야 한다. 대용 표준물질의 회수율도 70% 이상 130%이하이어야 한다.

① 검량선 작성

검량선 작성용 표준물질을 3)정성시험과 같은 방법으로 가스크로마토그래피/질량분석계에 주입하여 각 선택이온에 대한 크로마토그램을 작성하여 각 표준물질의 피크 면적과 이에 대응하는 13C12체의 피크 면적으로부터 다음 식에 의해 상대감응(RR)을 구한다. 상대감응은 5개 농도 이상의 검량선 작성용 표준물질을 사용하며 편차범위는 ±20% 이내이어야 한다

[eqn: RR = {(A sub 1n + A sub 2n ) (C sub l )} over {(A sub 1l + A sub 2l ) (C sub n ) }]

A1n, A2n : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 다이옥신류  의 1차 및 2차 선택 이온의 피크 면적

A1l, A2l : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 13C12체 화합        물의 1차 및 2차 선택 이온의 피크 면적

Cn : 검량선 작성용 표준물질의 농도

Cl : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 13C12체 표준물질의 농도

② 반응계수(RF)

반응계수(RF)는 검량선 작성용 표준물질을 분석하여 얻은 크로마토그램으로부터 내부표준물질방법에 따라 다음의 식에 의해 구한다. 5개 농도의 검량선 작성용 표준물질을 사용한 반응계수의 편차범위는 ±35% 이내이어야 한다.

[eqn: RF= {(A sub 1s ＋ A sub 2s )(C sub is )} over {(A sub 1is ＋ A sub 2is )(C sub s )}]

A1s, A2s : 검량선 작성용 표준물질의 1차 및 2차 선택이온의 피크 면적

A1is, A2is : 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 내부표준물질의 1차 및 2차 선택이온의 피크 면적

Cs; 검량선 작성용 표준물질의 농도

Cis; 검량선 작성용 표준물질에 첨가된 내부표준물질의 농도

③ 시료 중 다이옥신 농도(C)의 계산

시료 중 다이옥신 농도(C)는 다음 식에 의해 구한다.

[eqn: C(ng/g) = {(A sub 1n + A sub 2n ) (C sub l )} over {(A sub 1l + A sub 2l ) (RR)} times {V sub ex over W sub s}]

A1n, A2n : 시료에 함유된 대상물질의 1차 및 2차 선택이온의       피크 면적

A1l, A2l : A1n 와 A2n에 대응하는 시료에 첨가된 13C12체 화합      물의 1차 및 2차 선택 이온의 피크 면적

RR : 상대감응

Cl : 시료에 첨가된 13C12체 표준물질의 양(ng/㎖)

Vex : 추출용량(㎖)

Ws : 시료량 (g)

④ 동위원소 표준물질의 검출 농도 및 회수율

시료에 첨가된 동위원소 표준물질의 검출농도(Cl) 및 회수율은 다음 식에 의해 구한다.

[eqn: C sub l (ng/g)= { (A sub 1s ＋ A sub 2s )(C sub is )} over {(A sub 1is ＋ A sub 2is )RF }]

A1s, A2s; 동위원소 표준물질(13C12체 표준물질)의 1차 및 2차 선택이온의 피크 면적

A1is, A2is; 실린지 첨가용 내부 표준물질의 1차 및 2차 선택이온의 피크 면적

Cis; 실린지 첨가용 내부 표준물질의 농도

RF: 반응계수

[eqn: 회수율(%)= {검출농도} over {첨가농도}×100]

⑤ 독성등가환산농도(TEQ)

시료에 함유된 이성체에 대한 2,3,7,8-TCDD 독성등가환산농도(TEQ: Toxic Equivalents)는 시료 중 다이옥신 농도에 표 6-4의 독성등가계수(TEF: Toxicity Equivalent Factor)를 곱하여 구한다.

표 6-1. 대상물질

Congeners		m/z
		M+	(M+2)+	(M+4)+
P C D D	2378 TCDD	319.8965	321.8936	323.8906
	12378 PeCDD	353.8576	355.8546	355.8517
	123478 HxCDD	387.8186	388.8127	393.8097
	123678 HxCDD	387.8186	388.8127	393.8097
	123789 HxCDD	387.8186	388.8127	393.8097
	1234678 HpCDD	421.7796	423.7767	425.7737
	OCDD	455.7407	457.7377	459.7348
P C D F	2378 TCDF	303.9016	305.8987	307.8957
	12378 PeCDF	337.8627	339.8597	341.8567
	23478 PeCDF	337.8627	339.8597	341.8567
	123478 HxCDF	371.8237	373.8207	375.8178
	123678 HxCDF	371.8237	373.8207	375.8178
	123789 HxCDF	371.8237	373.8207	375.8178
	234678 HxCDF	371.8237	373.8207	375.8178
	1234678 HpCDF	405.7847	407.7818	409.7788
	1234789 HpCDF	405.7847	407.7818	409.7788
	OCDF	439.7457	441.7428	443.7398

주: 약어의 펼친 이름은 다음과 같음.

PCDD = poly chlorinated dibenzo dioxin	PCDF = poly chlorinated dibenzo furan

TCDD  = tetra chloro dibenzo dioxin	TCDF = tetra chloro dibenzo furan

PeCDD = penta chloro dibenzo dioxin	PeCDF = penta chloro dibenzo furan

HxCDD = hexa chloro dibenzo dioxin	HxCDF = hexa chloro dibenzo furan

HpCDD = hepta chloro dibenzo dioxin	HpCDF = hepta chloro dibenzo furan

OCDD = octa chloro dibenzo dioxin	OCDF = octa chloro dibenzo furan

표 6-2. 검출한계

4～5 염화물	6～7 염화물	8 염화물
0.01 pg/g	0.02 pg/g	0.05 pg/g

표 6-3. 염소원자수에 의한 동족체 피크의 자연존재비

	자연존재비
	M	M+2	M+4	M+6	M+8	M+10	M+12	M+14
4	76.5	100	48.7	10.5	0.9
5	61.5	100	65.0	21.1	3.5	0.2
6	51.2	100	81.2	35.2	8.5	1.1	0.06
7	43.2	100	97.5	52.8	17.1	3.3	0.36	0.02
8	33.8	87.9	100.0	65.0	26.4	6.8	1.1	0.10

표 6-4. 독성등가계수 (Toxicity Equivalent Factors; WHO-TEFs)

다이옥신류	WHO-TEFs
2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-TCDF 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,7,8-PeCDF 2,3,4,7,8-PeCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,2,3,6,7,8-HxCDD 1,2,3,7,8,9-HxCDD 1,2,3,4,7,8-HxCDF 1,2,3,6,7,8-HxCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDF 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF OCDD OCDF	1.0 0.1 1.0 0.5 0.05 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.01 0.01 0.01 0.0001 0.0001

부  칙

이 고시는 고시한 날부터 시행한다.